RINGKASAN
Vibrio parahaemolyticus (Vp) merupakan bakteri halofilik Gram negatif. Bakteri ini tumbuh pada kadar NaCl optimum 3%, kisaran suhu 5 – 43°C, pH 4.8 – 11 dan aw 0.94 – 0.99. Pertumbuhan berlangsung cepat pada kondisi suhu optimum (37°C) dengan waktu generasi hanya 9–10 menit. Seafood yang merupakan produk hasil laut, memberikan semua kondisi yang dibutuhkan oleh Vp untuk tumbuh dan berkembang biak: keberadaan garam, nutrien yang baik serta pH dan aw yang cocok sehingga Vp sering terdapat sebagai flora normal di dalam seafood. Mereka terkonsentrasi dalam saluran pencernaan moluska, seperti kerang, tiram dan mussel yang mendapatkan makanannya dengan cara mengambil dan menyaring air laut.
Strain Vp patogen merupakan penyebab penyakit gastroenteritis yang disebabkan oleh produk hasil laut (seafood), terutama yang dimakan mentah, dimasak tidak sempurna atau terkontaminasi dengan seafood mentah setelah pemasakan. Gastroenteritis berlangsung akut, diare tiba-tiba dan kejang perut yang berlangsung selama 48 – 72 jam dengan masa inkubasi 8 – 72 jam. Gejala lain adalah mual, muntah, sakit kepala, badan agak panas dan dingin. Pada sebagian kecil kasus, bakteri juga menyebabkan septisemia.
Sejak tahun 1997, jumlah kasus Kejadian Luar Biasa (KLB) yang disebabkan oleh Vp meningkat secara tajam di berbagai kawasan dunia. Terjadinya KLB ini telah teridentifikasi disebabkan oleh konsumsi seafood terutama tiram (oyster) mentah yang terkontaminasi oleh Vp. Sejak tahun 1997 tersebut, maka seafood terutama tiram dianggap sebagai jenis pangan yang penting diwaspadai dari aspek keamanan pangan. Strain Vp patogen penyebab gastroenteritis sangat beragam. Strain Vp patogen dengan serotype O3:K6 sejak tahun 1996 muncul menjadi sumber patogen baru penyebab keracunan pangan.
Kasus keracunan karena Vp lebih banyak terjadi pada musim panas. Kondisi ini berkorelasi positif dengan prevalensi dan jumlah kontaminasi Vp pada sampel seafood lingkungan yang juga meningkat dengan meningkatnya suhu perairan. Tingkat salinitas air laut juga berpengaruh pada tingkat kontaminasi.
Teknik analisis berpengaruh pada tingkat prevalensi dan tingkat isolasi Vp dari seafood. Untuk pengendalian tingkat kontaminasi didalam seafood, diperlukan pemilihan metode analisis yang lebih sensitifitas dengan waktu deteksi yang lebih cepat. Teknik analisis berdasarkan deteksi gen (tlh, tdh dan/atau trh) memberikan hasil yang lebih akurat untuk mendeteksi strain patogen dibandingkan dengan teknik MPN-konvensional yang berdasarkan pada reaksi biokimiawi.
Pada sampel seafood dari lingkungan dan pasar ritel, Vp patogen hanya terdeteksi dalam jumlah rendah (<100 sel per-gram). Prevalensi dan tingkat kontaminasi Vp dalam sampel seafood lingkungan dan pasar ritel juga seringkali jauh lebih kecil dari batas maksimum Vp yang diijinkan FDA didalam seafood yang akan dijual (104 sel per-gram). Kondisi ini juga terjadi pada sampel yang diambil selama terjadinya KLB. Sehingga, praktek penilaian seafood yang hanya didasarkan pada penghitungan total Vp sebagai deteksi keberadaan Vp patogen, hendaknya diperbaiki dengan juga mempertimbangkan faktor virulen tdh dan/atau trh. Tingkat kontaminasi maksimal yang diijinkan dalam seafood yang dijual juga perlu dikaji ulang.
Terjadinya kasus epidemik yang besar dengan mengkonsumsi seafood yang terdeteksi hanya mengandung Vp dalam jumlah kecil dapat disebabkan oleh beberapa faktor. Beberapa faktor penyebab diduga adalah kemampuan Vp patogen memproduksi tdh dapat diperkaya oleh adanya asam empedu terkonjugasi, asam glikokolat dan asam taurokolat dan atau dosis infeksi dari strain patogen yang sangat rendah.
Selama distribusi dan pemasaran, diperlukan praktek-praktek penanganan yang dapat menekan pertumbuhan mikroba. Praktek penyimpanan di suhu rendah (<4°C) dapat menekan dan menurunkan tingkat pertumbuhan Vp. Selain itu, proses pasteurisasi minimal (50°C, 15 menit) dan iradiasi sinar gamma 3 kGy dapat meningkatkan keamanan pangan dari produk-produk seafood.
PENDAHULUAN
Vibrio parahaemolyticus (Vp) adalah bakteri halofilik Gram negatif yang merupakan flora normal dari daerah estuaria dan pantai. Bakteri ini muncul secara musiman. Biasanya, pada musim panas Vp relatif mudah dideteksi pada air laut, sedimen, plankton, ikan, krustasea dan moluska yang merupakan tempat hidupnya di ekosistem. Mereka terkonsentrasi dalam saluran pencernaan moluska, seperti kerang, tiram dan mussel yang mendapatkan makanannya dengan cara mengambil dan menyaring air laut (Charles-Hernández et al., 2006).
Beberapa strain dari bakteri Vp, merupakan penyebab utama dari penyakit gastroenteritis yang disebabkan oleh produk hasil laut (seafood), terutama yang dimakan mentah, dimasak tidak sempurna atau terkontaminasi dengan seafood mentah setelah pemasakan. Gastroenteritis yang disebabkan oleh Vp berlangsung akut, diare yang tiba-tiba dan kejang perut yang berlangsung selama 48 – 72 jam. Masa inkubasi berkisar antara 8 – 72 jam dengan rata-rata sekitar 18 jam. Gejala lain yang dilaporkan dengan frekuensi yang berturut-turut menurun adalah mual, muntah, sakit kepala dan badan panas dingin. Pada sebagian kecil kasus, bakteri menyebabkan kerusakan (luka) pada mukosa usus sehingga tinja dari beberapa penderita selain mengandung bakteri, juga berdarah dan mengandung leukosit serta memicu terjadinya septisemia (Kaysner, 2000).
Kasus keracunan karena mengkonsumsi pangan tercemar Vp, biasanya berlangsung secara musiman. Karena Vp biasanya muncul pada saat suhu lingkungan perairan di atas 15°C, maka kasus keracunan karena Vp biasa terjadi pada musim panas dimana suhu permukaan laut naik hingga mencapai di atas 15°C (McLaughlin et al, 2005).
Sejak tahun 1997, jumlah kasus Kejadian Luar Biasa (KLB) yang disebabkan oleh Vp meningkat secara tajam di berbagai kawasan dunia. Terjadinya KLB ini telah teridentifikasi disebabkan oleh konsumsi seafood terutama tiram (oyster) mentah yang terkontaminasi oleh Vp. Sejak tahun 1997 tersebut, maka seafood terutama tiram dianggap sebagai jenis pangan yang penting diwaspadai dari aspek keamanan pangan.
Tulisan ini akan mencoba menjelaskan mengenai frekuensi isolasi Vp dari seafood, dan melihat faktor-faktor apa saja yang berpengaruh terhadap tingkat isolasi Vp dari seafood tersebut. Beberapa faktor yang akan dilihat adalah faktor lingkungan, teknik analisis yang digunakan serta aspek penyimpanan dan penanganan seafood. Diharapkan, kajian ini dapat menjelaskan keterkaitan antara frekuensi isolasi Vp dari dalam seafood dengan beberapa faktor yang mempengaruhinya dan dapat menjadi bahan masukan untuk pengembangan metode atau teknik pengendalian yang efisien untuk mengurangi resiko kontaminasi Vp dan menjamin keamanan pangan.
KARAKTERISTIK KEJADIAN LUAR BIASA Vp TERKAIT SEAFOODKejadian luar biasa keracunan pangan karena Vp (KLB Vp) didefinisikan sebagai kejadian dua atau lebih kasus penyakit dengan gejala klinis yang mirip, yang terjadi setelah mengkonsumsi suatu jenis seafood. Pada kasus infeksi Vp 1988 – 1997 di Florida, Alabama, Louisiana dan Texas, 59%-nya merupakan penyakit gastroenteritis, 8% dengan septisemia dan 34% dengan infeksi kulit. Sebanyak 88% dari penderita gastroenteritis tercatat mengkonsumsi tiram mentah sebelum sakit, sementara 91% penderita septisemia juga mengkonsumsi makanan yang sama sebelum sakit. Dari total 345 kasus, 45% di antaranya dirawat dan 4% meninggal dunia (Daniels et al., 2000).
1. Kasus-kasus KLB Vp Karena Konsumsi Seafood
Beberapa kasus KLB Vp di Chile karena konsumsi seafood mentah ditampilkan pada Tabel 1. Sebelum 2004, kasus keracunan karena Vp jarang terjadi di Chile dan hal ini terkait dengan kondisi suhu perairan yang rendah (11-16°C). Pada saat KLB terjadi, suhu permukaan air laut mencapai 18.3–19.2°C (Puerto Montt, KLB 2004 dan 2005) dan 20°C (Antofagasta, KLB 1997–1998).
Tabel 1. KLB keracunan pangan di Chile dan Spanyol, 1997 - 2005
Tahun | Jumlah kasus (daerah epidemi) | Pembawa |
Chile (Fuenzalida et al, 2005) | ||
1997 - 1998 | 300 (Antofagasta) | Ikan kulit keras (shellfish) mentah |
2004 | 1500 (Puerto Montt) | Ikan kulit keras (shellfish) mentah |
2005 | 3600 (Puerto Mont) 11000 (seluruh Chile) | |
Spanyol (Martinez-Urtaza et al, 2004 dan 2005) | ||
1999 | 64 (Galicia) | Tiram mentah |
2004 | 80 (A Coruña) | Kepiting rebus |
Di Spanyol, rekaman medis dari beberapa rumah sakit menunjukkan bahwa infeksi Vp lebih sering dari yang diduga. Dari rekaman medis, Vp teridentifikasi dari sampel klinis pasien gastroenteritis di Barcelona (1986, 1987 dan 1999), Zaragoza (1993) dan Madrid (1998 dan 2000). Kasus KLB terjadi pada tahun 1999 dan 2004, disebabkan oleh konsumsi seafood mentah dan yang telah dimasak (Tabel 1). Kepiting rebus yang merupakan penyebab KLB Juli 2004, dimasak pada kondisi higiene dan sanitasi yang buruk dan kemudian disimpan di suhu ruang selama beberapa jam sebelum dikonsumsi (Martinez-Urtaza et al, 2004 dan 2005).
Pada periode 1986 – 1995, setiap tahun rata-rata terjadi 85 KLB karena Vp. Insiden KLB Vp melonjak drastis pada 1996 dan bertahan hingga sekarang. Pada 1996–1999, 61-71% dari total KLB keracunan pangan di Taiwan disebabkan oleh Vp (Chiou et al, 2000).
Di Amerika Serikat, sepanjang 1973 – 1998 terjadi 40 kasus KLB Vp di 15 negara bagian dan wilayah Guam dengan 1064 penderita dan median tingkat serangan 56% (3 - 100%) dimana sebagian besar kasus terjadi di bulan Juli. Pembawa adalah seafood atau yang terkontaminasi dengan seafood, terutama yang dikonsumsi mentah (38% kasus) atau setengah matang. Penyebab utama adalah tiram dan kerang. Pada periode ini, 30% KLB terjadi pada 1997 – 1998 dan tiga diantaranya cukup besar. Pada Juli–Agustus 1997, keracunan disebabkan oleh konsumsi tiram mentah dari Puget Sound, Washington; dua kasus KLB gastroenteritis Vp pada Mei–Juni 1998 terjadi karena mengkonsumsi tiram mentah yang berasal dari Galveston Bay, Texas dan di akhir Juli 1998, KLB Vp terkait dengan konsumsi tiram dan kerang mentah yang berasal dari Teluk Oyster, Long Island, New York (Daniels et al, 2000).
Kasus KLB juga terjadi di Alaska pada Juli 2004, yang disebabkan oleh tiram Alaska dengan tingkat serangan 29%. Suhu air laut di daerah pemanenan pada Juli 2006 tercatat di atas 15°C (McLaughlin et al, 2005).
Kasus KLB Vp di New York, Oregon dan Washington, kembali terjadi pada 20 Mei – 31 Juli 2006 setelah mengkonsumsi tiram dan remis dalam bentuk mentah atau masak yang dimakan di restoran. Dari 177 kasus yang secara epidemiologis terhubung dengan infeksi Vp, 41% positif disebabkan oleh Vp berdasarkan analisis sampel klinis penderita. Tiram dan remis berasal dari daerah pantai Washington dan British Columbia, Canada; yang didistribusikan secara nasional ke pasar ikan dan restoran. Luasnya daerah pemasaran berdampak pada meluasnya daerah sebaran penyakit. Pada KLB 2006, 122 kasus berasal dari 17 sumber seafood yang sama. Kasus ini berimplikasi pada penutupan perusahaan pemanenan tiram yang merupakan pemasok utama tiram penyebab KLB (Balter et al, 2006).
Dari beberapa kasus KLB yang terjadi dapat disimpulkan bahwa keracunan karena Vp merupakan kasus musiman yang kemunculannya sangat terkait dengan meningkatnya suhu perairan. Dari data yang ditampilkan terlihat bahwa keracunan biasanya terjadi pada bulan-bulan yang suhunya hangat (musim panas), dimana suhu permukaan laut lebih besar dari 15°C. Seafood yang paling sering dilaporkan sebagai penyebab keracunan adalah tiram dan kerang.
Besarnya frekuensi keracunan karena Vp terkait juga dengan cara mengkonsumsi seafood. Besarnya prevalensi kasus keracunan Vp di Taiwan disebabkan oleh kebiasaan masyarakatnya untuk mengkonsumsi seafood dalam kondisi mentah. Kondisi yang sama tampaknya juga terjadi di beberapa negara Asia lainnya yang mempunyai kebiasaan mengkonsumsi seafood mentah, seperti Jepang dan Thailand.
Pada kasus keracunan yang terjadi setelah mengkonsumsi seafood yang dimasak, faktor penyebab adalah proses pemasakan yang tidak sempurna sehingga tidak membunuh semua Vp yang ada, atau proses penanganan yang buruk (kondisi higiene dan sanitasi tidak terjaga, seafood disimpan disuhu ruang selama beberapa jam sebelum diolah/dikonsumsi, atau terjadinya kontaminasi silang antara produk yang telah dimasak dengan produk mentah).
2. Karakteristik Vp patogen pada Sampel Klinis
Dilihat dari serotypenya, maka strain Vp patogen penyebab setiap kejadian KLB sangat beragam seperti ditampilkan pada Tabel 2. Walaupun demikian, menurut Chowdhury et al (2000) yang disitasi oleh Martinez-Urtaza et al (2004), pandemik Vp dalam beberapa tahun terakhir ini terutama disebabkan oleh tiga serotype utama yaitu O3:K6, O4:K68 dan O1:K untypeable (KUT).
Tabel 2. Serotype dominan pada beberapa sampel klinis KLB Vp
Daerah | Tahun | Strain penyebab dominan (serotype) | Referensi |
Spanyol | 1999 2004 | O4:K11 O3:K6 | Martinez-Urtaza et al, 2005 |
Chile | 1997-1998, 2004, 2005
| O3:K6 | Fuenzalida et al, 2005 |
Amerika Serikat | 1997 1998 2004 2006 | O4:K12 dan O1:K56 O3:K6 O6:K18 O4:K12 | Daniels et al, 2000 McLaughlin et al, 2005 Balter et al, 2006 |
Taiwan | 1995–1999 | O3:K6 | Chiou et al, 2000 |
Vp dari strain O3:K6 pertama kali diketahui sebagai penyebab pandemik pada 1996 di Asia Tenggara (Fuenzalida, et al, 2005). Isolat memiliki gen toxR, tlh dan tdh, tidak memiliki trh dan positif sebagai strain pandemik dari klon pandemic O3:K6 (Martinez-Urtaza et al, 2005).
Sumber: Martinez-Urtaza et al (2004)
Di Amerika Serikat, walaupun muncul pada 1998, serotype O3:K6 tidak menjadi penyebab utama kasus tahun 1997, 2004 dan 2004. Vp dominan dari sampel klinis KLB 1997 memiliki serotype O4:K12 dan O1:K56. Pada KLB 2004 di Alaska, serotype mayoritas dalam sampel klinis adalah O6:K18 sementara 18 dari 23 isolat Vp kasus 2006 merupakan serotype O4:K12 (McLaughlin et al, 2005; Balter et al, 2006).
Seperti di Amerika Serikat, data serotype Vp yang diisolasi dari sampel klinis di dareah Asia, Amerika dan Eropa (Tabel 3) menunjukkan bahwa strain Vp patogen yang diisolasi di daerah Asia sangat beragam tetapi dari 1985-1999, sebagian besar didominasi oleh strain dengan serotype O3:K6 (Martinez-Urtaza et al, 2004). Dari paparan diatas bisa dikatakan bahwa sejak 1996, Vp strain O3:K6 merupakan bakteri patogen baru yang harus diwaspadai.
PENGARUH LINGKUNGAN TERHADAP PREVALENSI DAN TINGKAT CEMARAN Vp DI DALAM SEAFOOD
Beberapa penelitian pada sampel seafood dari lingkungan menunjukkan prevalensi dan tingkat kontaminasi Vp yang sangat beragam (Tabel 4). Di daerah dengan empat musim prevalensi Vp biasanya meningkat selama musim panas, sementara di daerah beriklim tropis seperti India, prevalensi Vp di dalam sampel seafood dari lingkungan mencapai hampir 100% (Deepanjali et al, 2005). Secara umum, tingkat kontaminasi yang terjadi <1000 CFU/g. Pada kasus KLB, tingkat cemaran di dalam sampel seafood dari lingkungan hanya sedikit yang nilainya > 104 koloni/gram (batas maksimum total Vp di dalam seafood yang akan dijual, yang direkomendasikan FDA) seperti dilaporkan oleh DePaole et al (2000) dan DePaola et al (2003).
Beberapa hasil penelitian secara jelas menunjukkan bahwa terdapat korelasi yang kuat antara prevalensi Vp dan tingkat kontaminasinya di dalam seafood dengan kondisi lingkungan perairan tempat seafood tersebut berasal. Dari beberapa penelitian (Tabel 4) disimpulkan bahwa suhu air berkorelasi positif dengan prevalensi Vp dan tingkat kontaminasinya di dalam air. Prevalensi dan tingkat kontaminasi Vp pada seafood lebih sering terjadi di musim panas atau pada daerah perairan yang suhunya diatas 15°C.
Tabel 4. Pengaruh ekologis lingkungan perairan terhadap prevalensi dan tingkat kontaminasi Vp di dalam seafood
No | Sampel | Hasil | Referensi |
1 | Tiram dari berbagai daerah pesisir USA, beberapa minggu setelah KLB Vp (1997 - 1998) |
| DePaola et al, 2000 |
2 | Tiram (Crassostrea virginica) dari Mobile Bay, Alabama (Mei 1998 – April 1999) |
| Gooch et al, 2002 |
3 | Moluska, 671 sampel dari pantai negara bagian Gulf dan Atlantic (1999 – 2000) |
| Cook et al, 2002 |
4 | Tiram, dari Mobile Bay Alabama (Juni, Juli, September 2001@ 20 perbulan |
| Kaufman et al, 2003 |
5 | Sampel tiram, dari Mobile Bay Alabama sampling dua-mingguan (Maret 1999 – September 2000) |
| DePaola et al, 2003 |
6 | Air laut dan bahan organik dari pantai Laut Seto-Inlad Jepang; pada musim dingin | Teknik MPN-PCR:
Teknik MPN-kultur konvensional:
| Alam et al, 2002 |
7 | Air laut dan bahan organik dari pantai Laut Seto-Inlad Jepang; pada musim panas | Teknik MPN-PCR:
Teknik MPN-kultur konvensional:
| Alam et al, 2003 |
8 | 800 sampel (12 batch) tiram dari sebuah muara sungai di daerah timur laut Brazil |
| De Sousa et al, 2004 |
9 | 309 sampel moluska & sampel klinis dr Chile barat daya (Januari 2004 – Maret 2005) |
| Fuenzalida et al, 2005 |
204 sampel moluska (Januari – Maret 2004 dan 2005 (KLB Vp)) |
| ||
25 dari 48 sampel positif Vp pada musim panas 2005 |
| ||
10 | 2 sampel tiram dari Alaska (saat kejadian KLB, Juni 2004) |
| McLaughlin et al, 2005 |
29 sampel tiram Alaska (21 Juli – 15 September 2004) |
| ||
11 | Tiram, dari estuaria sepanjang pantai India barat daya |
| Deepanjali et al, 2005 |
Salinitas air juga berpengaruh terhadap prevalensi dan tingkat kontaminasi Vp kedalam seafood. Cook et al. (2002) menduga salinitas optimal untuk Vp adalah 19 ppt, dan jumlah Vp akan lebih rendah jika salinitas berada di luar salinitas optimal tersebut. Kondisi tingkat salinitas air yang berfluktuasi sangat lebar dan jauh dari kisaran optimal pertumbuhan Vp, diduga sebagai salah satu penyebab rendahnya prevalensi dan tingkat cemaran Vp yang terdeteksi pada seafood (de Sousa, 2004). Daerah atau habitat asal seafood berpengaruh terhadap prevalensi dan tingkat cemaran Vp didalam seafood dan hal ini mungkin disebabkan oleh kondisi suhu air dan kadar salinitasnya.
Beberapa penelitian dengan data terbatas menyebutkan prevalensi dan tingkat isolasi Vp patogen di dalam seafood selama musim panas meningkat dengan menurunnya suhu perairan (DePaola et al, 2003 dan McLaughlin et al, 2005). Diduga, strain Vp yang patogen lebih tahan terhadap suhu perairan yang lebih dingin, dan secara perlahan digantikan oleh strain yang non patogen dengan meningkatnya suhu perairan (McLaughlin et al, 2005). Strain Vp patogen yang terdeteksi sangat beragam dan strain Vp patogen yang pandemik hanya terdeteksi pada sedikit sampel, bahkan pada sampel seafood selama terjadinya KLB.
PENGARUH TEKNIK ANALISIS TERHADAP PREVALENSI DAN TINGKAT CEMARAN Vp DI DALAM SEAFOOD
Fuenzalida et al (2005) yang mensitasi dari beberapa literatur menyebutkan bahwa rendahnya tingkat cemaran Vp (termasuk Vp patogen) dapat disebab-kan oleh rendahnya recovery dari Vp dengan menggunakan prosedur analisis yang digunakan. Rendahnya tingkat recovery ini bisa disebabkan oleh prevalensi dari strain yang hidup tetapi tidak bisa tumbuh di dalam media uji (viable but non-culturable). Beberapa penelitian yang melihat prevalensi dan tingkat kontaminasi Vp didalam seafood terkait dengan teknik analisis, dirangkum pada Tabel 5.
Penentuan total Vp dapat dilakukan dengan metode MPN konvensional yang dikembangkan oleh BAM (menggunakan konfirmasi biokimia) atau dengan pemupukan pada media non selektif yang dilanjutkan dengan deteksi menggunakan pelacak (probe) gen tlh (thermolabile hemolysin). Sementara untuk identifikasi strain Vp patogen dapat dilakukan dengan uji kanagawa atau menggunakan pelacak DNA dengan atau tanpa kombinasi dengan PCR (Polymerase Chain Reaction-perbanyakan kopi sekuens DNA) untuk mendeteksi gen tdh dan trh didalam Vp (BAM, 2004).
Teknik analisis sangat berpengaruh pada tingkat isolasi bakteri dan waktu analisis. Dari beberapa penelitian (Tabel 5) dikatakan bahwa metode pelacak DNA berkorelasi sangat baik dengan teknik penghitungan konvensional menggunakan konfirmasi biokimia, dengan waktu analisis yang lebih cepat.
Untuk strain patogen, analisis dengan pelacak gen jauh lebih sensitif dibandingkan dengan teknik analisis konvensional. Pada hasil penelitian yang dilaporkan oleh Alam et al (2002), diketahui bahwa teknik PCR dengan menggunakan isolat DNA yang berasal dari media pengkayaan memberikan hasil yang jauh lebih baik dari metode MPN konvensional (MPN-BAM). Prevalensi Vp mencapai 95% dengan deteksi gen tdh dan trh mencapai 20% dari sampel, sementara prevalensi dengan teknik konvensional hanya 40% dan tidak bisa mendeteksi keberadaan gen tdh dan trh (Tabel 5).
Media yang digunakan untuk deteksi vibrio dalam pangan dan air dikembangkan berdasarkan pertimbangan kemampuan bakteri ini untuk tumbuh cepat pada pH alkali, tahan terhadap efek penghambatan yang diberikan oleh garam empedu dan natrium tellurite, dan toleran terhadap garam (NaCl). Media pengkayaan yang umum digunakan untuk Vibrio adalah APW (broth alkaline peptone water), NTSB (salt trypticase soy broth) dan SPB (salt polimiksin broth). Penelitian Hara-Kudo et al (2001) menyebutkan bahwa pengkayaan dua tahap memberikan hasil recovery Vp yang lebih baik dibandingkan pengkayaan 1 tahap.
Sebagai media selektif, TCBS (thiosulfate-citrate-bile-saccharose) adalah yang paling umum digunakan. Kelemahan media ini adalah tidak terlalu spesifik membedakan Vp dari V. hollisae, V. mimicus dan V. vulnificus yang sama-sama membentuk koloni berwarna hijau. Hara-Kudo et al (2001) mengembangkan media selektif CV (chromogenic agar) yang mengandung substrat untuk ß-galaktosidase (CV) pada CV agar, yang bisa membedakan Vp dari koloni peng-ganggu sebagai koloni berwarna violet (Gambar 1). Prevalensi Vp didalam sea-food lebih tinggi jika menggunakan media selektif CV (65% pada pengkayaan 1 tahap dan 80% pada pengkayaan 2 tahap) daripada media TCBS (50 pada pengka-yaan 1 tahap dan 70% dengan pengkayaan 2 tahap) dengan tingkat isolasi yang juga lebih baik.
Gambar 1. Koloni Vp pada agar CV (a, warna ungu) dan TCBS (b, warna hijau)
Vp menyukai kisaran suhu 5 - 43°C untuk pertumbuhannya, dengan suhu pertumbuhan optimum 37°C. Pertumbuhan berlangsung cepat pada kondisi suhu optimum, dengan waktu generasi hanya 9–10 menit. Nilai pH optimum pertumbuhan Vp adalah 4.8–11, dan ketahanan terhadap keasaman akan meningkat jika suhu lingkungan mendekati kondisi suhu pertumbuhan optimum. Walaupun lebih menyukai kondisi lingkungan anaerob untuk pertumbuhannya, Vp juga dapat tumbuh pada kondisi aerob. Bakteri ini tergolong halofilik dengan kadar NaCl optimum 3% dan membutuhkan aw 0.94-0.99 dengan optimum 0.98 untuk pertumbuhannya (Kaysner, 2000).
Seafood yang berasal dari daerah laut, memberikan semua kondisi yang dibutuhkan oleh Vp untuk tumbuh dan berkembang biak: keberadaan garam, nutrien yang baik serta pH dan aw yang cocok. Guna mencegah terjadinya bahaya karena mengkonsumsi seafood, perlu dilihat prevalensi dan tingkat kontaminasi Vp pada seafood yang dijual di tingkat ritel serta pengaruh kondisi penanganan pasca panen seafood terhadap prevalensi dan tingkat kontaminasi Vp didalamnya. Beberapa hasil penelitian terkait dengan kondisi penanganan pasca panen ini dapat dilihat pada Tabel 6.
Tabel 5. Evaluasi beberapa teknik analisis Vp
No | Sampel | Metode | Hasil | Referensi |
1 | Tiram | MPN-VPAP labeled DNA probe dengan Direct-VPAP labeled DNA-probe (tlh-Vp) |
| Ellison et al, 2001 |
2 | Tiram | MPN-VPAP -vs- di-rect-VPAP & direct-VPDig (digoxigenin-labeled probe) |
| Gooch et al, 2001 |
3 | Seafood |
|
| Hara-Kudo et al, 2001 |
4 | Air laut dan bahan organik | Teknik MPN-PCR (menggunakan isolat DNA dari media pengkayaan) dan Teknik MPN-kultur konvensional |
| Alam, et al, 2002 |
5 | Seafood | MPN-PCR (deteksi gen tlh) dan MPN-TCBS; pengkayaan pada APW (Alkalin Peptone Water) |
| Miwa et al, 2003 |
6 | Tiram, 131 ekor | Real time-PCR dan streak plate APW-probe DNA utk tdh |
| Blacstone, et al, 2003 |
Dari hasil penelitian ini disimpulkan bahwa prevalensi Vp dalam seafood di tingkat ritel bervariasi dari 6.32% (Franco-Monsreal dan Flores-Abuxapqui, 1989) sampai 90% (Kaufman et al, 2003). Di Amerika Serikat, prevalensi Vp dalam seafood ritel dalam jumlah besar (90%) ditemukan pada sampel musim panas (Kaufman et al, 2003).
Penelitian Miwa et al (2006) terhadap sampel seafood dari pasar ritel Jepang menyebutkan bahwa prevalensi Vp dalam sampel moluska lebih besar dari sampel udang. Tingkat prevalensi juga ditemukan jauh lebih tinggi pada seafood yang akan dimasak daripada yang akan dimakan mentah.
Tabel 6. Tingkat cemaran Vp di dalam seafood pasca panen
No | Sampel | Waktu | Hasil | Referensi |
1 | Seafood dari restoran, kota Yucatan, Mexico; 190 sampel: mentah, masak tidak sempurna, masak parsial dengan perebusan | Maret-Agustus 1987 | Prevalensi Vp: 6.32% | Franco-Monsreal dan Flores-Abuxapqui, 1989 |
2 | Hancuran daging tiram, T 4°C, 0°C, -18°C, -24°C | Jumlah Vp merupakan fungsi log dari log waktu. | Muntada-Garriga et al, 1995 | |
Penyimpanan suhu rendah signifikan menurunkan Vp | ||||
3 | Tiram, pasteurisasi 50°C, 15 menit | Proses min. 10 menit efektif menurunkan jumlah Vp dari >10000 mjd tdk terdeteksi | Andrew et al, 2000 | |
4 | Tiram dari 4 restoran, 3 pasar induk di Gainesville, Fla. (@ dua sampel), bulanan | September 1997 - Mei 1998 | Jumlah rata-rata Vp sampel tertinggi di bulan Oktober 1997 (3000 CFU/g); Vp ting-gi sepanjang September-November 1997 | Ellison, et al, 2001 |
5 | Tiram (Crassostrea virgin-ica) dari Mobile Bay, Alabama | Mei 1998 - April 1999 | Jam ke-0: jumlah Vp oleh suhu air pada saat panen: T air > 20C, nilai Vp rata-rata 130 CFU/g; T air < 20C, Vp rata-rata 15 CFU/g | Gooch et al, 2002 |
10 jam penyimpanan di 26C, Vp dalam tiram hidup naik 50 kali lipat (log 1.7 CFU/g) | ||||
24 jam penyimp. di 26C, Vp dalam tiram hidup naik 790 kali lipat (log 2.9 CFU/g) | ||||
penyimpanan 14 hari di 3C (setelah disimpan di 26C selama 24 jam), Vp turun mjd 1/6 jumlah sblm disimpan dingin (log 0.8 CFU/g) | ||||
6 | Tiram 370 lot, pasar ritel USA (71% dari restoran); disuplay dari Gulf Coast Pasifik, Mid-Atlantic, North Atlantic dan Canada | Juni 1998 - Juli 1999 | Jumlah Vp seafood pada musim panas >10000 MPN/g | Cook, et al, 2002 |
Tingkat cemaran dipengaruhi oleh lokasi asal panen | ||||
Tingkat cemaran menurun (7%/hari) selama penyimpanan di pasar ritel | ||||
tdh terdeteksi pd 9/3429 (0.3%) kultur Vp atau 4% lot tiram | ||||
Desember 1997 - Mei 1998 Vp didalam sampel < 100/g | ||||
7 | Seafood (tiram, kerang), 329 sampel, Jepang |
| Prevalensi gen tdh 10%; jumlah <3 - 93 per-10 g | Harakudo et al, 2003 |
8 | Tiram hidup, di iradiasi sinar gamma (60Co) | Dosis 1 kGy menurunkan tk kontaminasi Vp sebesar 6-10 log. Sampai dosis 3 kGy, tidak membunuh tiram & ti-dak menyebabkan penyimpangan bau, flavor & penampakan | Jakabi et al, 20003 | |
9 | Tiram, diambil perbulan @ 20 sampel, dari Mobile Bay Alabama | Juni, Juli, September 2001 | saat panen, Vp pd 90% sam-pel (dari 10) 200–2000CFU/ 00 lm nsi l, t;0.91, 2.88±0.36;alam litian onal, en meman pelacak DNA akan memnpa kombinasi dilanjutkan dengan deteksi menggung; (Juni, juli, September berturut-turut log 2.90±0.91, 2.88±0.36; 2.47±0.26 CFU/g | Kaufman et al, 2003 |
40% sampel bulan Juni dan Juli 2001mengandung Vp patogen (10 - 20 CFU/g), Vp patogen negatif | ||||
Setelah penyimpanan 24 jam di suhu ruang, Vp dalam tiram hidup meningkat 13 - 26 kali lipat. Vp terdeteksi pada beberapa tiram dengan jumlah lebih dari 100 CFU/g | ||||
10 | Seafood dari pasar retail, Jepang |
| Prevalensi Vp dalam seafood untuk konsumsi mentah: 55% (11/20) pada udang; 96.7% (29/30) pd moluska | Miwa et al, 2006 |
Jumlah Vp dlm seafood un-tuk konsumsi mentah < 104 MPN/100g dalam semua sampel udang yang diuji dan >104 MPN/100g dalam 36.7% sampel moluska | ||||
Prevalensi Vp dalam seafood untuk konsumsi masak: 45% (9/20) pada udang; 100% (20/20) pada moluska | ||||
Jumlah Vp dlm seafood un-tuk konsumsi masak > 104 MPN/100g dalam 5% sam-pel udang & >104 MPN/100g dalam 90% sampel moluska | ||||
Jumlah Vp patogen pd sam-pel seafood yang akan dimakan mentah dibawah limit deteksi (<30MPN/100g) | ||||
Prevalensi Vp patogen pada sampel moluska untuk kon-sumsi masak 35%; jumlah 3.6x10 - 1.1x103MPN/100g | ||||
Insiden Vp patogen cenderung lebih besar jk cemaran Vp dalam sampel tinggi | ||||
Serotype sebag. besar strain patogen dlm 11/33 sampel dgn tdh+ adl O3:K6 dan merupakan klon pandemik | ||||
11 | Sampel 300 seafood yang dipanen di daerah Cina Timur |
| Prevalensi Vp 26% dengan teknik konvensional & 32.3% dengan teknik TaqMan PCR | Cai, et al, 2006 |
12 | Tiram | Prevalensi Vp 51.5%; Vp patogen 12.1% | Ward dan Bej, 2006 |
Pada beberapa kasus yang meneliti prevalensi dan tingkat kontaminasi Vp didalam seafood selama terjadinya KLB (Tabel 6) diketahui bahwa jumlah Vp di dalam sampel selama periode kejadian tersebut jauh lebih kecil dari batas maksimum yang diijinkan oleh FDA, yaitu 104 sel per-gram. Rendahnya tingkat kontaminasi Vp (<104 sel per-gram) di dalam sampel seafood yang diambil dari tempat asal seafood penyebab kontaminasi ini menyebabkan perlunya peninjauan kembali terhadap batas maksimal tingkat cemaran Vp yang diijinkan di dalam seafood terutama yang akan dikonsumsi mentah. Rendahnya prevalensi dan tingkat cemaran Vp patogen (<100 sel per-gram) di dalam seafood yang terdeteksi selama terjadinya KLB, menyebabkan perlu pula dibuat standar tingkat kontaminasi Vp patogen maksimal di dalam seafood terutama yang akan dikonsumsi.
Terjadinya kasus epidemik yang besar dengan mengkonsumsi seafood yang terdeteksi hanya mengandung Vp dalam jumlah kecil dapat disebabkan oleh beberapa faktor. Untuk Vp patogen, penelitian Osawa dan Yamai (1996) secara in vitro membuktikan bahwa kemampuan Vp patogen memproduksi tdh dapat diperkaya oleh adanya asam empedu terkonjugasi, asam glikokolat dan asam taurokolat. Selain itu, diduga bahwa dosis infeksi dari strain patogen sangat rendah (Fuenzalida et al, 2005).
Pertumbuhan Vp berlangsung cepat pada penyimpanan di suhu ruang dan dapat diperlambat atau diturunkan dengan penyimpanan di suhu rendah. Didalam media hancuran tiram, jumlah Vp dapat diturunkan jika suhu penyimpanan adalah 4, 0, -18 atau –24°C (Muntada-Garriga et al,1995). Penurunan jumlah Vp sebesar 7% per-hari juga dilaporkan terjadi pada tiram yang disimpan pada kondisi komersial (Cook et al, 2002). Pada penelitian lain, pertumbuhan Vp didalam tiram diukur pada 26°C, menunjukkan peningkatan sebesar log 1.7 setelah penyimpanan 10 jam dan log 2.9 setelah penyimpanan 24 jam (Gooch et al, 2002). Jika sampel tiram kemudian disimpan pada 3°C, maka jumlah Vp akan menurun sebesar log 0.8 setelah 14 hari penyimpanan.
Dari laporan penelitian di atas, kita dapat menyimpulkan bahwa pada seafood yang disimpan di suhu refrigerasi, tidak terjadi pertumbuhan dan malahan terjadi penurunan jumlah dari Vp. Hanya saja, pemanenan yang berlangsung pada kondisi suhu air yang relatif tinggi (misalnya di musim panas), mungkin menye-babkan seafood mengalami penundaan waktu untuk mencapai suhu aman (suhu refrigerasi) yang memungkinkan terjadinya pertumbuhan Vp pada periode itu. Selain hal ini, faktor keterlambatan penyimpanan di suhu rendah juga menyebabkan peningkatan jumlah Vp.
Beberapa proses penanganan pasca panen efektif untuk menekan tingkat kontaminasi Vp didalam seafood. Seperti dilaporkan Andrew et al (2000), proses pasteurisasi tiram pada suhu 50°C selama minimal 10 menit efektif untuk menurunkan jumlah Vp dari >10000 koloni menjadi tidak terdeteksi. Proses iradiasi sinar gamma (Co60) juga dapat menurunkan tingkat kontaminasi Vp (Jakabi et al, 2003). Dosis 1 kGy bisa menurunkan tingkat kontaminasi Vp sebesar 6-10 log. Sampai dosis 3 kGy, proses tidak membunuh tiram dan juga tidak menyebabkan penyimpangan bau, flavor dan penampakan tiram.
KESIMPULAN- Seafood terutama tiram yang dimakan mentah merupakan jenis pangan yang paling sering membawa Vp penyebab gastroenteritis. Kasus keracunan karena Vp lebih banyak terjadi pada musim panas. Strain Vp patogen penyebab gastroenteritis sangat beragam. Strain Vp patogen dengan serotype O3:K6 sejak tahun 1996 muncul menjadi sumber patogen baru penyebab keracunan pangan.
- Prevalensi dan jumlah kontaminasi Vp pada sampel seafood lingkungan meningkat dengan meningkatnya suhu perairan. Tingkat salinitas air laut juga berpengaruh pada tingkat kontaminasi.
- Teknik analisis berpengaruh pada tingkat prevalensi dan tingkat isolasi Vp dari seafood. Untuk pengendalian tingkat kontaminasi didalam seafood, diperlukan pemilihan metode analisis yang lebih sensitifitas dengan waktu deteksi yang lebih cepat.
- Prevalensi dan tingkat kontaminasi Vp dalam sampel seafood lingkungan dan pasar ritel seringkali jauh lebih kecil dari batas maksimum yang diijinkan FDA (104 sel per-gram) termasuk pada beberapa kasus KLB.
- Pada sampel seafood dari lingkungan dan pasar ritel, Vp patogen hanya terdeteksi dalam jumlah rendah (<100 sel per-gram), bahkan pada sampel yang berasal dari lokasi KLB.
- Praktek penilaian seafood yang hanya didasarkan pada penghitungan total Vp sebagai deteksi keberadaan Vp patogen, hendaknya diperbaiki dengan juga mempertimbangkan faktor virulen tdh dan/atau trh. Tingkat kontaminasi maksimal yang diijinkan ada didalam seafood yang dijual juga perlu dikaji ulang.
- Praktek penyimpanan di suhu rendah (<4°C) dapat menekan dan menurunkan tingkat pertumbuhan Vp. Selain itu, proses pasteurisasi minimal (50°C, 15 menit) dan iradiasi sinar gamma 3 kGy dapat meningkatkan keamanan pangan dari produk-produk seafood.
DAFTAR PUSTAKA
Alam, M.J., S. Miyoshi, S. Shinoda. 2003. Studies on pathogenic Vibrio parahaemolyticus during a warm weather season in the Seto Inland Sea, Japan. Environ Microbiol. Aug;5(8):706-10.
Andrews, L.S., D.L. Park, Y.P. Chen. 2000. Low temperature pasteurization to reduce the risk of vibrio infections from raw shell-stock oysters. Food Addit Contam. Sep;17(9):787-91
Balter et al. 2006. Vibrio parahaemolyticus Infections Associated with Consumption of Raw Shellfish – Three States, 2006. http://www.cdc.gov/epo/dphsi/phs/infdis.htm. Diakses 20 Desember 2006.
Blackstone, G.M., J.L. Nordstrom JL, M.C. Vickery, M.D. Bowen, R.F. Meyer, A. DePaola. 2003. Detection of pathogenic Vibrio parahaemolyticus in oyster enrichments by real time PCR. J Microbiol Methods. May;53(2):149-55.
Cai T, L. Jiang, C. Yang, K. Huang. 2006. Application of real-time PCR for quantitative detection of Vibrio parahaemolyticus from seafood in eastern China. FEMS Immunol Med Microbiol. Mar;46(2):180-6.
Charles-Hernández, G.L., E. Cifuentes, S.J. Rothenberg. 2006. Environmental factors associated with the presence of Vibrio parahaemolyticus in sea products and the risk of food poisoning in communities bordering the Gulf of Mexico. Journal of Environmental Health Research, Vol. 5 issue 2
Chiou, C-S., S-Y. Hsu, S-I. CHIU, T-K WANG dan C-S. CHAO. 2000. Vibrio parahaemolyticus Serovar O3:K6 as Cause of Unusually High Incidence of Food-Borne Disease Outbreaks in Taiwan from 1996 to 1999. J. of Clinical Microbiol. Dec., p. 4621–4625 Vol. 38, No. 12
Cook, D.W, P. Oleary, J.C. Hunsucker, E.M. Sloan, J.C. Bowers, R.J. Blodgett, A. Depaola. 2002. Vibrio vulnificus and Vibrio parahaemolyticus in U.S. retail shell oysters: a national survey from June 1998 to July 1999. J Food Prot. Jan;65(1):79-87.
Cook, D.W., J.C. Bowers, A. DePaola. 2002. Density of total and pathogenic (tdh+) Vibrio parahaemolyticus in Atlantic and Gulf coast molluscan shellfish at harvest. J. Food Prot. Dec;65(12):1873-80
Daniels, N.A., L. MacKinnon, R. Bishop, S. Altekruse, B. Ray, R.M. Hammond, S. Thompson, S. Wilson, N.H. Bean, P.M. Griffin and L. Slutsker. 2000. Vibrio parahaemolyticus Infections in the United States, 1973–1998. The Journal of Infectious Diseases;181:1661–6.
de Sousa, O.V., R.H. Vieira, F.G. de Menezes, C.M. dos Reis, E. Hofer. 2004. Detection of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae in oyster, Crassostrea rhizophorae, collected from a natural nursery in the Coco river estuary, Fortaleza, Ceara, Brazil. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. Mar-Apr;46(2):59-62. Epub 2004 May 5.
Deepanjali, A., H.S. Kumar, I. Karunasagar, I. Karunasagar. 2005. Seasonal variation in abundance of total and pathogenic Vibrio parahaemolyticus bacteria in oysters along the southwest coast of India. Appl Environ Microbiol. Jul;71(7):3575-80.
DePaola, A., C.A. Kaysner, J. Bowers, D.W. Cook. 2000. Environmental investigations of Vibrio parahaemolyticus in oysters after outbreaks in Washington, Texas, and New York (1997 and 1998). Appl Environ Microbiol. Nov;66(11):4649-54.
DePaola, A., J. Ulaszek, C.A. Kaysner, B.J. Tenge, J.L. Nordstrom, J. Wells, N. Puhr, S.M. Gendel. 2003. Molecular, serological, and virulence characteristics of Vibrio parahaemolyticus isolated from environmental, food, and clinical sources in North America and Asia. Appl Environ Microbiol. Jul;69(7):3999-4005.
Ellison, R.K., E. Malnati, A. Depaola, J. Bowers, G.E. Rodrick. 2001. Populations of Vibrio parahaemolyticus in retail oysters from Florida using two methods. J Food Prot. May;64(5):682-6.
Franco-Monsreal, J. dan J. Flores-Abuxapqui J. 1989. Prevalence of Vibrio parahaemolyticus in seafood from restaurants in the city of Merida, Yucatan. Salud Publica Mex. May-Jun;31(3):314-25.
Fuenzalida, L., C. Hernández, J. Toro, M.L. Rioseco, J. Romero dan R.T. Espejo. 2006. Vibrio parahaemolyticus in shellfish and clinical samples during two large epidemics of diarrhoea in southern Chile. Society for Applied Microbiology and Blackwell Publishing Ltd, Environmental Microbiology.
Gooch, J.A., A. DePaola A, C.A. Kaysner, D.L. Marshall. 2001. Evaluation of two direct plating methods using nonradioactive probes for enumeration of Vibrio parahaemolyticus in oysters. Appl Environ Microbiol. Feb;67(2):721-4
Gooch, J.A., A. DePaola, J. Bowers, D.L. Marshall. 2002. Growth and survival of Vibrio parahaemolyticus in postharvest American oysters. J Food Prot. Jun;65(6):970-4.
Gooch, J.A., A. DePaola, J. Bowers, D.L. Marshall. 2002. Growth and survival of Vibrio parahaemolyticus in postharvest American oysters. J Food Prot. Jun;65(6):970-4.
Hara-Kudo, Y., K. Sugiyama, M. Nishibuchi, A. Chowdhury, J. Yatsuyanagi, Y. Ohtomo, A. Saito, H. Nagano, T. Nishina, H. Nakagawa, H. Konuma, M. Miyahara, S. Kumagai. 2003. Prevalence of pandemic thermostable direct hemolysin-producing Vibrio parahaemolyticus O3:K6 in seafood and the coastal environment in Japan. Appl Environ Microbiol. Jul;69(7):3883-91.
Hara-Kudo, Y., T. Nishina, H. Nakagawa, H. Konuma, J. Hasegawa, S. Kumagai. 2001. Improved method for detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood. Appl Environ Microbiol. Dec;67(12):5819-23.
Jakabi, M, D.S. Gelli, J.C. Torre, M.A. Rodas, B.D. Franco, M.T. Destro, M. Landgrafi. 2003. Inactivation by ionizing radiation of Salmonella enteritidis, Salmonella infantis, and Vibrio parahaemolyticus in oysters (Crassostrea brasiliana). J Food Prot. 2003 Jun;66(6):1025-9.
Kaufman, G.E., A.K. Bej, J. Bowers, A. DePaola. 2003. Oyster-to-oyster variability in levels of Vibrio parahaemolyticus. J Food Prot. Jan;66(1):125-9 DePaola, A., J.L. Nordstrom, J.C. Bowers, J.G. Wells, D.W. Cook. 2003. Seasonal abundance of total and pathogenic Vibrio parahaemolyticus in Alabama oysters. Appl Environ Microbiol. 2003 Mar;69(3):1521-6.
Kaysner, C.A. 2000. Vibrio species. Didalam The Microbilogical Safety and Quality of Food (Vol. II). Lund., B.M., T.C. Baird-Parker dan G.W. Gould (Ed). Aspen Publisher, Inc. Gaithersburg, Maryland.
Martinez-Urtaza, J., A. Lozano-Leon, A. DePaola, M. Ishibashi, K. Shimada, M. Nishibuchi dan E. Liebana. 2004. Characterization of Pathogenic Vibrio parahaemolyticus Isolates from Clinical Sources in Spain and Comparison with Asian and North American Pandemic Isolates. Journal of Clinical Microbiology, Oct 2004, Vol. 42, No. 10 (p. 4672–4678). American Society for Microbiology.
Martinez-Urtaza, J., L. Simental, D. Velasco, A. DePaola, M. Ishibashi, Y. Nakaguchi, M. Nishibuchi, D. Carrera-Flores, C. Rey-Alvarez dan A. Pousa. 2005. Pandemic Vibrio parahaemolyticus O3:K6, Europe. Emerging Infectious Diseases. www.cdc.gov/eid. Vol. 11, No. 8, August 2005.
McLaughlin, J.B., A. DePaola, C.A. Bopp, K.A. Martinek, N.P. Napolilli, C.G. Allison, S.L. Murray, E.C. Thompson, M.M. Bird, and J.P. Middaugh. 2005. Outbreak of Vibrio parahaemolyticus Gastroenteritis Associated with Alaskan Oysters. The new england journal of medicine 353;14 www.nejm.org October 6
Miwa N, M. Kashiwagi, F. Kawamori, T. Masuda, Y. Sano, M. Hiroi, H. Kurashige. 2006. Levels of Vibrio parahaemolyticus and thermostable direct hemolysin gene-positive organisms in retail seafood determined by the most probable number-polymerase chain reaction (MPN-PCR) method. Shokuhin Eiseigaku Zasshi. Apr;47(2):41-5.
Miwa N, Nishio T, Arita Y, Kawamori F, Masuda T, Akiyama M. 2003. Evaluation of MPN method combined with PCR procedure for detection and enumeration of Vibrio parahaemolyticus in seafood. Shokuhin Eiseigaku Zasshi. Dec;44(6):289-93.
Miwa N, T. Nishio, Y. Arita, F. Kawamori, T. Masuda, M. Akiyama. 2003. Evaluation of MPN method combined with PCR procedure for detection and enumeration of Vibrio parahaemolyticus in seafood. Shokuhin Eiseigaku Zasshi. Dec;44(6):289-93
Muntada-Garriga, JM, J.J. Rodriguez-Jerez, El. Lopez-Sabater, M.T. Mora-Ventura. 1995. Effect of chill and freezing temperatures on survival of Vibrio parahaemolyticus inoculated in homogenates of oyster meat. Lett Appl Microbiol. Apr;20(4):225-7.
Osawa, R dan S. Yamai. 1996. Production of thermostable direct hemolysin by Vibrio parahaemolyticus enhanced by conjugated bile acids. Appl Environ Microbiol. Aug;62(8):3023-5.
Sharp, A.N. 2000. Detection of microorganisms in foods: principles of physical method for separation and associated chemical and enzymological methods of detection. Didalam The Microbilogical Safety and Quality of Food (Vol. II). Lund., B.M., T.C. Baird-Parker dan G.W. Gould (Ed). Aspen Publisher, Inc. Gaithersburg, Maryland.
Vuddhakul, V., S. Soboon, W. Sunghiran, S. Kaewpiboon, A. Chowdhury, M. Ishibashi, Y. Nakaguchi, M. Nishibuchi. 2006. Distribution of virulent and pandemic strains of Vibrio parahaemolyticus in three molluscan shellfish species (Meretrix meretrix, Perna viridis, and Anadara granosa) and their association with foodborne disease in southern Thailand. J Food Prot. Nov;69(11):2615-20
Ward, LN dan A.K. Bej. 2006. Detection of Vibrio parahaemolyticus in shellfish by use of multiplexed real-time PCR with TaqMan fluorescent probes. Appl Environ Microbiol. Mar;72(3):2031-42.
